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本试剂盒是一种利用荧光探针DCFHDA进行组织活性氧检测的试剂盒，DCFHDA ROS探针为绿色荧光的活性氧探针，具有488/520nm的最大激发/发射波长。

DCFHDA ROS探针在组织中活性氧存在的条件下，被氧化生成绿色荧光物质，绿色荧光强度与组织内活性氧水平成正比，检测DCFHDA产物的荧光就可以知道组织内活性氧的水平。在激发波长488nm，发射波长520nm附近，使用荧光分光光度计、荧光酶标仪、等检测DCFHDA产物荧光，从而测定组织内活性氧水平。

一般最好使用新鲜组织样本检测活性氧，反映的是组织当时的活性氧状态。冻存的组织样本的ROS在长期冻存过程中会损失掉，有条件的话就使用新鲜样本，不建议使用冻存的样本。已经冻存的组织样本中残余的ROS也可以用本试剂盒检测。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。

• 使用方便：可用荧光分光光度计、荧光酶标仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

• 染料2周内可2～8℃保存，长期不用可以-20℃保存。避免反复冻融。
  
• 探针为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

• 荧光分光光度计/荧光酶标仪
  
• PBS/HBSS(无酚红)
  
• 蛋白定量试剂盒
  
• 荧光检测专用黑色96孔板

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• DCFHDA探针染色液为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。

• 试剂准备：
  根据样本数量，用纯水将DCFHDA探针10倍稀释。充分混匀，备用。
  
  • 不可以一次性将探针全部稀释。
    
  • 现配现用。
• 样本处理：
  
  • 刚取得的新鲜组织样本用PBS洗净。
    
  • 准确称取50～100mg组织，加入1mL匀浆缓冲液A，用匀浆器/匀浆机充分匀浆。
    
  • 在100×g，4℃离心3分钟，弃沉淀，取上清。
• 样本检测：
  
  • 在96孔板中加入190μL匀浆上清液、10μL DCFHDA探针，用移液器吹打，使之充分混匀。
    
  • 在37℃避光孵育30分钟。
    
  • 置于荧光酶标仪中，后于激发波长为488nm、发射波长530nm检测荧光强度。
    
    • 或使用荧光分光光度计等其他荧光检测设备。
      
    • 必须使用荧光检测专用的黑色96孔板。
      
    • 如荧光强度太强，超过了仪器的检测范围，可将孵育后的匀浆上清液稀释后再检测。一般稀释5～50倍。
• 蛋白定量：
  
  • 另取50μL上清匀浆液，用PBS大约稀释30倍。
    
  • 取100μL进行蛋白定量。
• 结果处理：
  以荧光强度(RFU)/蛋白浓度(毫克蛋白)表示组织活性氧强度。
  
  • 数据与蛋白浓度的单位无关。
    
  • 此处以蛋白浓度数据作为校正系数，对不同样品进行均一化处理。